相同點(diǎn):均能實(shí)現(xiàn)高純度、高活性的細(xì)胞分選。
不同點(diǎn):美天旎磁珠因磁珠粒徑小,磁性弱,需要搭配分選柱進(jìn)行磁性的放大才能實(shí)現(xiàn)細(xì)胞分離,操作時(shí)長(zhǎng)約30-60分鐘(分選柱需預(yù)沖洗、上樣、洗滌等步驟)。海貍細(xì)胞分選試劑盒不需要分選柱,僅需磁力架搭配流式管,最快15分鐘(陰選法)即可分離細(xì)胞。
用于細(xì)胞分選磁力架的磁場(chǎng)強(qiáng)度要>7000Gs,否則會(huì)影響細(xì)胞分選效果。
推薦海貍細(xì)胞分選磁力架(Cat.No: 60205,60205Ⅱ,60206)。
我們未對(duì)激活處理后的脾臟或淋巴細(xì)胞進(jìn)行T細(xì)胞分選驗(yàn)證。
從理論上講,陰選方式由于不直接結(jié)合目標(biāo)細(xì)胞,通常不受激活處理影響;而陽(yáng)性選擇則可能受到一定影響,尤其是在T細(xì)胞激活后某些表面標(biāo)志物表達(dá)發(fā)生變化的情況下,可能存在洗脫效率降低的風(fēng)險(xiǎn)。
建議客戶(hù)在完成細(xì)胞分選后再進(jìn)行激活處理,可以確保分選效果和細(xì)胞狀態(tài)的穩(wěn)定性。
可以,海貍的細(xì)胞分選試劑盒,從組織或者其他樣本里分選出來(lái)的都是原代細(xì)胞。
圈所有染上色的細(xì)胞,(要看染的部位,細(xì)胞碎片、死細(xì)胞染不上)。
E1左下角細(xì)胞碎片不要圈,P1圈對(duì)角線(xiàn)(單個(gè)核細(xì)胞)
可能是磁吸不充分導(dǎo)致的,可以延長(zhǎng)磁吸時(shí)間或更換磁性更強(qiáng)的磁力架(>7000Gs)。
我們自己用的300 nm的SA(Cat. No. 22308C)做細(xì)胞分選,包括陽(yáng)選和陰選。
目前有客戶(hù)用的1μm SA(Cat. No. 22307)自己做分選,效果也很好。
含有2 mM EDTA和2% 胎牛血清(FBS)的PBS或者含有2 mM EDTA和0.5% BSA的PBS,需預(yù)先通過(guò)0.22μm濾膜過(guò)濾除菌??梢月?lián)系海貍生物購(gòu)買(mǎi)預(yù)配制的分選buffer(Cat. No. 80301)。
自己配制分選buffer時(shí)建議使用0.5 M的液體EDTA。原因:固體的EDTA比較難溶解,溶解后也可能會(huì)有肉眼看不到的顆粒,所以要過(guò)0.22μm的濾膜,但過(guò)濾膜可能會(huì)損失掉部分EDTA,所以建議用液體的。
因?yàn)榭贵wmix中只有少量的紅細(xì)胞抗體,防止有紅細(xì)胞殘留,所以需要裂紅。
陽(yáng)選中只有一種抗體,即針對(duì)目的細(xì)胞的抗體;陰選中是抗體mix,含有多種針對(duì)非目標(biāo)細(xì)胞的抗體。
陽(yáng)選法:適用樣本類(lèi)型多種、復(fù)雜,抗體類(lèi)型單一,需要解離試劑,直接捕獲,細(xì)胞沒(méi)有磁珠標(biāo)記,有抗體標(biāo)記,操作時(shí)長(zhǎng)最快80min,不需要分離柱。
陰選法:適用樣本類(lèi)型相對(duì)單一,抗體類(lèi)型為多種抗體的混合物,不需要解離試劑;間接捕獲,不影響細(xì)胞性能;細(xì)胞沒(méi)有磁珠標(biāo)記和抗體標(biāo)記,操作時(shí)長(zhǎng)最快25min,不需要分離柱。
含有2 mM EDTA和2% 胎牛血清(FBS)的PBS或者含有2 mM EDTA和0.5% BSA的PBS,需預(yù)先通過(guò)0.22μm濾膜過(guò)濾除菌??梢月?lián)系海貍生物購(gòu)買(mǎi)預(yù)配制的分選buffer。
推薦進(jìn)行2次過(guò)篩。
第一次過(guò)篩:將樣本置于70 μm細(xì)胞篩網(wǎng)篩網(wǎng)上進(jìn)行研磨/沖洗,收集細(xì)胞。
第二次過(guò)篩:裂紅完成后,使用PBS重懸細(xì)胞,將細(xì)胞懸液用70 μm細(xì)胞篩網(wǎng)過(guò)濾。
若只進(jìn)行1次過(guò)篩,殘留的細(xì)胞團(tuán)塊可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞/磁珠聚集,降低分選純度。
磁珠使用前需要用分選buffer清洗2次(清洗方法見(jiàn)說(shuō)明書(shū));若不清洗,磁珠保存液中的某些組分(如抑菌劑)可能會(huì)影響細(xì)胞活性。
將細(xì)胞懸液加到離心管底部,再加入Biotin-Antibody Mix,充分吹打混勻(盡量在底部進(jìn)行吹打,不要濺到管壁上),4°C孵育 10 min(勿將Ep管插進(jìn)冰里)。
若孵育時(shí)間不足,會(huì)使抗體與細(xì)胞無(wú)法充分結(jié)合,從而導(dǎo)致非目標(biāo)細(xì)胞殘留,影響分選純度。
要使用細(xì)胞分選專(zhuān)業(yè)磁力架,推薦(Cat. No. 60205/60206),靜置5分鐘,磁吸后轉(zhuǎn)移大部分懸液至新管,注意不要吸到磁珠。磁吸時(shí)間過(guò)短可能會(huì)導(dǎo)致部分磁珠未完全吸附,分選后的細(xì)胞中有磁珠殘留,且影響分選純度。
常規(guī)離心條件為500 g,5分鐘(磁珠清洗除外,需10000 g,1分鐘)。離心速度過(guò)大(超過(guò)500g)影響細(xì)胞活性。
吹散不會(huì)影響細(xì)胞后續(xù)擴(kuò)增,結(jié)團(tuán)的細(xì)胞從原理上來(lái)說(shuō)是細(xì)胞增殖的團(tuán)。
這種情況是正常激活現(xiàn)象,背景中散落的細(xì)胞在良好激活情況下,細(xì)胞形態(tài)會(huì)變大,與control會(huì)出現(xiàn)形態(tài)上的區(qū)別。正常的小鼠(未進(jìn)行造模)分選后CD3 T細(xì)胞,按照使用說(shuō)明刺激24-48h,都可以實(shí)現(xiàn)CD25CD69>80%的激活響應(yīng)。
可以通過(guò)流式檢測(cè)CD25CD69(24h、48h,需要同時(shí)檢測(cè)不加磁珠的對(duì)照組),對(duì)比marker的表達(dá)情況做出是否激活的判斷。如果想要得到更加迅速、高效的激活響應(yīng),可以適當(dāng)增加磁珠用量,或者在24h-48h之間吹打混勻孔內(nèi)的細(xì)胞和磁珠,幫助細(xì)胞和磁珠再次充分接觸,但是具體實(shí)驗(yàn)效果需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪M(jìn)行調(diào)整,并不是激活響應(yīng)越快、越高就越好。
剛加入磁珠和細(xì)胞下落后,結(jié)合沒(méi)有那么快,可以等24h再觀察
磁珠去不去除都可以。如果需要去除磁珠,可以在細(xì)胞激活后開(kāi)始聚團(tuán)擴(kuò)增的時(shí)候去除,一般是在激活后48-72小時(shí),鏡下可以看到聚團(tuán)擴(kuò)增的T細(xì)胞時(shí),通過(guò)移液槍輕柔吹打的方式吹散細(xì)胞,磁吸去除磁珠。磁珠去除后,在IL-2(或其他常規(guī)可以使用的細(xì)胞因子)作用下,正??梢詳U(kuò)增7-14天。
如果用于T細(xì)胞激活,推薦5μm SA(Cat. No. 22306)和5μm (Cat. No. 70105)羧基磁珠。