相同點:均能實現(xiàn)高純度、高活性的細胞分選。
不同點:美天旎磁珠因磁珠粒徑小,磁性弱,需要搭配分選柱進行磁性的放大才能實現(xiàn)細胞分離,操作時長約30-60分鐘(分選柱需預沖洗、上樣、洗滌等步驟)。海貍細胞分選試劑盒不需要分選柱,僅需磁力架搭配流式管,最快15分鐘(陰選法)即可分離細胞。
用于細胞分選磁力架的磁場強度要>7000Gs,否則會影響細胞分選效果。
推薦海貍細胞分選磁力架(Cat.No: 60205,60205Ⅱ,60206)。
我們未對激活處理后的脾臟或淋巴細胞進行T細胞分選驗證。
從理論上講,陰選方式由于不直接結(jié)合目標細胞,通常不受激活處理影響;而陽性選擇則可能受到一定影響,尤其是在T細胞激活后某些表面標志物表達發(fā)生變化的情況下,可能存在洗脫效率降低的風險。
建議客戶在完成細胞分選后再進行激活處理,可以確保分選效果和細胞狀態(tài)的穩(wěn)定性。
正常情況下,一個脾臟大概的細胞數(shù)量是5x10*7-1x10*8。
但細胞數(shù)量與鼠齡、小鼠品系還有單細胞懸液制備都有關(guān)系.
可以,海貍的細胞分選試劑盒,從組織或者其他樣本里分選出來的都是原代細胞。
圈所有染上色的細胞,(要看染的部位,細胞碎片、死細胞染不上)。
E1左下角細胞碎片不要圈,P1圈對角線(單個核細胞)
可能是磁吸不充分導致的,可以延長磁吸時間或更換磁性更強的磁力架(>7000Gs)。
我們自己用的300 nm的SA(Cat. No. 22308C)做細胞分選,包括陽選和陰選。
目前有客戶用的1μm SA(Cat. No. 22307)自己做分選,效果也很好。
含有2 mM EDTA和2% 胎牛血清(FBS)的PBS或者含有2 mM EDTA和0.5% BSA的PBS,需預先通過0.22μm濾膜過濾除菌??梢月?lián)系海貍生物購買預配制的分選buffer(Cat. No. 80301)。
自己配制分選buffer時建議使用0.5 M的液體EDTA。原因:固體的EDTA比較難溶解,溶解后也可能會有肉眼看不到的顆粒,所以要過0.22μm的濾膜,但過濾膜可能會損失掉部分EDTA,所以建議用液體的。
因為抗體mix中只有少量的紅細胞抗體,防止有紅細胞殘留,所以需要裂紅。
陽選中只有一種抗體,即針對目的細胞的抗體;陰選中是抗體mix,含有多種針對非目標細胞的抗體。
陽選法:適用樣本類型多種、復雜,抗體類型單一,需要解離試劑,直接捕獲,細胞沒有磁珠標記,有抗體標記,操作時長最快80min,不需要分離柱。
陰選法:適用樣本類型相對單一,抗體類型為多種抗體的混合物,不需要解離試劑;間接捕獲,不影響細胞性能;細胞沒有磁珠標記和抗體標記,操作時長最快25min,不需要分離柱。
含有2 mM EDTA和2% 胎牛血清(FBS)的PBS或者含有2 mM EDTA和0.5% BSA的PBS,需預先通過0.22μm濾膜過濾除菌。可以聯(lián)系海貍生物購買預配制的分選buffer。
推薦進行2次過篩。
第一次過篩:將樣本置于70 μm細胞篩網(wǎng)篩網(wǎng)上進行研磨/沖洗,收集細胞。
第二次過篩:裂紅完成后,使用PBS重懸細胞,將細胞懸液用70 μm細胞篩網(wǎng)過濾。
若只進行1次過篩,殘留的細胞團塊可能會導致細胞/磁珠聚集,降低分選純度。
磁珠使用前需要用分選buffer清洗2次(清洗方法見說明書);若不清洗,磁珠保存液中的某些組分(如抑菌劑)可能會影響細胞活性。
將細胞懸液加到離心管底部,再加入Biotin-Antibody Mix,充分吹打混勻(盡量在底部進行吹打,不要濺到管壁上),4°C孵育 10 min(勿將Ep管插進冰里)。
若孵育時間不足,會使抗體與細胞無法充分結(jié)合,從而導致非目標細胞殘留,影響分選純度。
要使用細胞分選專業(yè)磁力架,推薦(Cat. No. 60205/60206),靜置5分鐘,磁吸后轉(zhuǎn)移大部分懸液至新管,注意不要吸到磁珠。磁吸時間過短可能會導致部分磁珠未完全吸附,分選后的細胞中有磁珠殘留,且影響分選純度。
常規(guī)離心條件為500 g,5分鐘(磁珠清洗除外,需10000 g,1分鐘)。離心速度過大(超過500g)影響細胞活性。
分選后的細胞懸液可直接用于流式檢測、細胞培養(yǎng)、RNA/蛋白提取等實驗;若不立即使用可在4℃短期保存(≤2小時)。因小鼠中性粒細胞體外生存周期短,分選后的細胞,建議盡快安排實驗。
一般情況下,股骨和脛骨大概2x10^7~5x10^7個細胞,因個人操作差異原因,有所不同。
正常小鼠1ml的外周血可以拿到 2~4 × 10^6個白細胞(若小鼠為炎癥模型,白細胞數(shù)可顯著升高),其中中性粒細胞占比大概為15%-25%(不同品系有所不同),可以計算一下最多能提出的中性粒細胞數(shù)。
得率在50%-70%都是正常的(分選前中性粒細胞占比x總的細胞數(shù)量x50%-70%)
以下是WT小鼠骨髓細胞、脾臟細胞、外周血分選前后純度:
小鼠骨髓細胞,分選前后CD11b+ Ly6G+ 中性粒細胞的純度為:45.72%和95.18%。
小鼠脾臟細胞,分選前后CD11b+ Ly6G+ 中性粒細胞的純度為:6.30%和91.84%。
小鼠外周血,分選前后CD11b+ Ly6G+ 中性粒細胞的純度分別為:20.04%和93.82%。
適用于分選小鼠骨髓、外周血或脾臟中性粒細胞,不適用于其他樣本類型(如肝臟、肺組織等)。原因在于該試劑盒采用陰選法,用生物素標記抗體結(jié)合非目標細胞,再通過磁珠去除。其他樣本中的非目標細胞類型可能不同,缺少對應(yīng)的抗體標記,會導致分選純度下降。
可根據(jù)樣本類型來決定是否需要裂解紅細胞(如:小鼠骨髓細胞不裂解紅細胞也可直接進行分選,但分選細胞純度可能隨紅細胞占比增加有5%以內(nèi)小幅度下降);裂紅時,可根據(jù)組織樣本及所用裂解液的不同調(diào)整用量及時間(如:小鼠外周血樣本裂解需要相對更長的時間,若一次裂解不充分,也可進行二次裂解)。
每100 μL細胞懸液(含1×10?個細胞)需加入2 μL Biotin-Antibody Mix 和20μL清洗過的磁珠。分選細胞數(shù)量增加時,需按比例擴大抗體和磁珠用量(詳見說明書)。
細胞濃度過高或過低都會影響分選效果。細胞濃度過高時,細胞容易聚集,導致抗體和細胞結(jié)合不充分,部分非目標細胞可能無法被很好的標記,進而影響分選純度;細胞濃度過低則會導致目標細胞得率降低。